1.拷贝数变异CNV的源码生物信息学分析（二）
2.Samtools安装
3.snippy calling snps 群体snp分析
4.Hi-C技术辅助组装软件Lachesis安装
5.转录组比对软件STAR安装及使用

拷贝数变异CNV的生物信息学分析（二）

       Control-FREEC是一种用于检测拷贝数变异和等位基因不平衡的生物信息学工具，最初由巴黎居里研究所生物信息学实验室开发。安装它适用于全基因组测序、源码全外显子测序和目标区域捕获测序。安装分析全基因组数据时，源码无需对照样本；而进行全外显子组或靶向测序时，安装unity源码必须提供对照样本。源码Control-FREEC能够自动计算、安装归一化、源码片段拷贝数和等位基因频率（BAF），安装并根据这些信息呼叫拷贝数变异和等位基因丢失（LOH）。源码全基因组测序数据分析时，安装程序还可能利用GEM创建的源码映射性数据。CNA检测输入格式包括对齐的安装单端、成对或配对数据的源码SAM、BAM、SAMtools堆格式，且支持.gz压缩文件。CNA+LOH检测输入有两选项：提供SAMtools堆格式的对齐读取文件，文件可通过gzip压缩；或提供BAM文件与“makePileup”和“fastfile”选项，用于识别增益、损失和LOH区域、归一化拷贝数和BAF。

       输出文件包括：扩增、缺失和LOH区域、归一化拷贝数和BAF文件。ssm框架源码Control-FREEC提供了一系列使用指南，包括安装、测试数据、配置文件创建、输出文件阅读、R脚本计算预测显著性、输出可视化、格式转换以及生成GC含量概览等。软件包含三个子目录：data目录保存配置文件模板，包含WGS和WES模板；script目录包含常用脚本；src目录为软件源代码，其中freec可执行文件位于src目录下。

       为了使用Control-FREEC，需要下载并安装miniconda，然后在新建的conda环境中进行安装。在新建的freec文件目录中，有三个主要目录：data目录用于配置文件模板，scripts目录包含常用脚本，src目录包含源代码和freec可执行文件。在使用Control-FREEC之前，需要先安装R、samtools、bedtools和sambamba等软件，或通过conda安装。mappability跟踪文件可用于增加映射信息。此外，石器时代 源码如果数据覆盖度高且希望检测等位基因状态，则需要下载SNP文件并将其转换为pileup格式。

       最后，下载示例数据集以进行测试。例如，可以从指定网址获取HCC和HCC-BL的数据，或获取用于测试LOH预测的未公开的肿瘤染色体数据。

Samtools安装

       è§£åŽ‹ä¹‹åŽï¼Œå¤šäº†ä¸€ä¸ªæ–‡ä»¶å¤¹samtools-1..1，里面有很多个文件，其中有一个configure文件，用于配置安装变量。

        从源码安装软件：

        把可执行文件所在bin文件夹放到环境变量$PATH中，方便在任何路径运行程序：

        通过直接输入samtools查看其有哪些命令:

        从上面命令输出可以看到，大致有5类命令：Indexing,Editing,File operations,Statistics,Viewing。

        常用命令的使用方法可以参考： /p/6b7adf

snippy calling snps 群体snp分析

       Snippy 是一个用于快速单倍体变体调用和核心基因组比对的工具。它能在单倍体参考基因组和您的NGS序列读数之间发现SNP，包括替换（snps）和插入/删除（indels）。Snippy 会尽可能使用更多的CPU，因为它可以在一台计算机上使用多达个内核。它的设计注重速度，并在一个文件夹中生成一组一致的输出文件。此外，它可以使用相同的参考获取一组Snippy结果，并生成核心SNP比对，最终生成系统发育树。

       安装 Snippy 时，推荐使用 conda 进行依赖安装。源码安装时可能会因为共享库文件不匹配的问题导致snippy自带的一些第三方软件无法使用，如samtools、bcftools、freebayes等。在检查所有依赖项是收银台源码否已安装并正常工作之前，请注意，由于snippy最新一次更新是//，其他软件或已更新。目前已知使用的snpeff版本不能是最新版（v5.1），需要上一个版本：snippy=4.6.0和snpeff=5.0兼容（测试时间//）。如遇执行问题，可检查依赖软件版本问题，此处列出snippy=4.6.0版本的依赖软件版本。

       Snippy 可以使用双端测序的reads数据，对于没有reads的细菌菌株，可以使用基因组文件或contigs.fa 文件。其原理是模拟二代测序将基因组文件拆分成生成reads的fq文件用于比对。需要注意的是，作为输入的FASTA文件夹不能存在带文件夹的相对路径，必须在当前目录。例如，/its1/GB_BT2/yzhishuang/data/tem/snippy/Yb2_genomic.fna 或者 Yb2_genomic.fna 可以，但是./Yb2_genomic.fna不行（经测试这个问题仅出现在集群服务器运行时，普通linux系统不存在此问题）。

       输出文件支持TAB、CSV、HTML格式的列。如果提供Genbank文件--reference而不是FASTA文件，Snippy将使用基因组注释填写这些额外的列，以告诉您哪个功能受到变体的源码部落影响。详细查看变体可查看 snippy-vcf_report。如果您使用该--report选项运行Snippy，它将自动运行 snippy-vcf_report 并为每个SNP生成包含以下内容的部分snps.vcf。如果希望在运行Snippy 后生成此报告，可以直接运行它。如果要在Web浏览器中查看HTML版本，请使用以下--html选项。它适用samtools tview于每个变体的运行，如果您有个变体，这可能会非常慢。使用--cpus建议尽可能高。

       Snippy 可以产生“核心SNP”的比对，可用于构建高分辨率的系统发育（忽略可能的重组）。核心位点是存在于所有样品中的基因组位置，可以是单态或多态。如果我们忽略“ins”，“del”变种类型的并发症，并且只使用变异位点，则这些是“核心SNP基因组”。为了简化针对相同引用的一组隔离序列（reads或contigs）的运行，可以使用 snippy-multi 脚本。此脚本需要一个制表符分隔的输入文件，可以处理双端测序reads，单端reads和组装的contigs。然后就可以运行它来生成输出脚本。第一个参数应该是input.tab文件。其余参数应为任何剩余的共享snippy参数。在ID将用于每个分离的--outdir。命令：它还将snippy-core在最后运行以生成核心基因组SNP比对文件core.*。

       Snippy 不能直接用于群体snp calling 分析，但是利用snippy-multi多菌株snp calling 基于生成的bam文件可以一步分析得到群体合并在一个vcf 文件里面的变异信息，用于下游的分析。重要步骤：使用freebayes-parallel并行freebayes 从全部个体的bam文件中分析变异信息。一个运行脚本全文：

Hi-C技术辅助组装软件Lachesis安装

       Lachesis软件，由shendurelab开发，用于辅助基因组组装，其发表于nat bio杂志。然而，在安装此软件时，用户会面临一系列挑战。软件的依赖包繁多，且对版本有严格要求。在使用conda进行安装时，发现缺少必要的依赖包，使得安装过程变得复杂。

       在安装过程中，需要安装两个依赖包：一个较低版本的samtools（低于0.1.）和C++库boost（版本在1..0至1..0之间）。为了满足boost库的版本要求，用户需要查询服务器上boost库的版本。通过查询发现，服务器上的boost库版本满足要求，可以少安装一个依赖包。

       接下来，用户需要安装0.1.版本的samtools和剩余的依赖包。之后，尝试安装Lachesis，但遇到错误。错误提示用户需要指定有效的samtools安装路径，或者通过命令行参数进行指定。通过修改源代码中指向实际samtools安装路径的#include语句，问题得以解决。

       安装过程中还遇到了另一个问题。使用conda安装的samtools虽然能在命令行中运行，但提示samtools安装不正确。深入分析后发现，conda安装的bin目录下没有sam.h文件，而手动安装的版本有此文件。通过手动安装0.1.版本的samtools并设置环境变量，解决了此问题。

       值得注意的是，Lachesis软件并无conda版本，且其开发团队已停止维护。GitHub主页推荐使用其他工具进行组装。尽管如此，用户出于之前的结题报告需求，仍选择了安装此软件。然而，在安装过程中，用户了解到软件存在安装困难、无法处理多倍体、长期未维护以及运行时问题。用户表示，后期可能不会使用此软件。

       安装工作最终完成，用户开始准备在数据到来之前，从公众数据库下载数据并进行相关的分析。本文通过文章同步助手进行同步。

转录组比对软件STAR安装及使用

       STAR，这个转录组比对工具，是ENCODE计划的重要工具，在转录组文章中常被提及。其特点包括较高的唯一比对率、将未配对映射的reads剔除、对质量较低的比对有较高容忍度等。使用GATK对RNA-Seq进行变异位点调用时，会采用STAR的2-pass模式。在使用过程中，需注意正确设置参数以避免错误。

       在进行STAR的安装时，先从GitHub下载对应的版本，使用tar命令解压，然后进入源代码目录使用make命令构建程序。在解压目录下，有多个可运行的STAR命令，选择其中一个执行，例如第二个版本的STAR命令。

       构建基因组索引是STAR使用的关键步骤。通过设置参数，如线程数、运行模式、基因组目录、参考基因组文件、注释文件、reads长度最大值等，完成索引构建。在构建过程中，需注意参数选择，如使用正确的染色体命名方式。若在构建过程中遇到错误，需检查输入的文件格式、内容及参数设置。

       STAR具有大量的参数设置，包括比对时允许的最大错配数、MAPQ值调整、reads文件操作、输入FASTQ文件路径、唯一剪切位点的reads考虑、内含子长度设定等。通过合理设置这些参数，可以优化比对结果，满足后续分析需求。

       在比对完成后，通过samtools查看生成的BAM文件，可以得到reads在基因组和转录本上的比对位置、统计信息、剪切位点信息等结果。分析这些结果时，需要关注BAM文件的处理过程，如去重等。

       总结来说，STAR在转录组比对方面有其独特的优势和使用技巧，但其参数设置复杂，需根据具体情况进行合理选择。正确使用STAR，可以提高比对效率和准确性，为后续的转录组分析提供坚实的基础。